【如何分离外周血单个核细胞】在免疫学、细胞生物学和临床研究中，外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）是重要的研究对象。PBMCs 包括淋巴细胞（如T细胞、B细胞、NK细胞）和单核细胞等，广泛应用于免疫功能分析、疫苗研发、肿瘤免疫治疗等领域。因此，掌握一种高效、稳定的PBMC分离方法至关重要。
以下是对“如何分离外周血单个核细胞”的总结性说明，并结合实际操作流程整理成表格形式，便于理解和参考。
一、实验原理
PBMC的分离主要基于密度梯度离心法。利用Ficoll或Lymphoprep等密度梯度介质，根据细胞的密度差异进行分层。红细胞和粒细胞因密度大沉于管底，而PBMC因密度较小浮于介质与血浆界面，从而实现有效分离。
二、实验材料与试剂
| 名称 | 规格/型号 | 用途 |
| 外周血样本 | 约5-10mL | 实验来源 |
| Ficoll-Paque 或 Lymphoprep | 1.077g/mL | 密度梯度介质 |
| PBS缓冲液 | 无钙镁 | 洗涤细胞 |
| 无菌离心管 | 50mL | 离心用 |
| 无菌移液器及吸头 | 各种规格 | 操作工具 |
| 生理盐水 | 0.9% | 洗涤细胞 |
三、实验步骤（简要）
| 步骤 | 操作内容 |
| 1 | 将外周血样本加入到含有抗凝剂（如EDTA）的采血管中，避免凝固。 |
| 2 | 将血液缓慢加到预先准备好的Ficoll-Paque溶液上，形成分层。 |
| 3 | 进行水平离心（如400g，30分钟，不刹车），使细胞按密度分层。 |
| 4 | 收集位于Ficoll与血浆之间的单个核细胞层。 |
| 5 | 用PBS洗涤细胞2-3次，去除残留的Ficoll和杂质。 |
| 6 | 调整细胞浓度，用于后续实验（如流式细胞术、细胞培养等）。 |
四、注意事项
| 注意事项 | 说明 |
| 抗凝处理 | 血液必须使用抗凝剂，防止凝固影响分离效果。 |
| 操作速度 | 加样时需缓慢，避免破坏分层结构。 |
| 离心参数 | 不同仪器可能需要调整转速和时间，需根据设备说明书设定。 |
| 细胞活性 | 分离后的细胞应尽快使用，或适当保存（如冻存）。 |
| 无菌操作 | 所有操作应在无菌条件下进行，避免污染。 |
五、结果判断
- 成功分离的PBMC应呈乳白色薄层，位于Ficoll与血浆之间。
- 镜检可见大量淋巴细胞和单核细胞，红细胞和粒细胞较少。
- 可通过流式细胞术或台盼蓝染色检测细胞活性和纯度。
六、常见问题与解决方法
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
| 分离后细胞量少 | 血液量不足或离心条件不当 | 增加血液量，优化离心参数 |
| 细胞活性低 | 操作时间过长或未及时洗涤 | 缩短操作时间，加强洗涤 |
| 杂质多 | 分层不清或Ficoll质量差 | 保证分层清晰，使用高质量介质 |
通过以上步骤和注意事项，可以较为顺利地完成外周血单个核细胞的分离工作。此方法适用于大多数实验室环境，具有较高的可重复性和实用性。
